干扰慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中对ALR表达

干扰慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中对ALR表达 [标签:url] [标签:科室] 摘要：构建肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration，ALR）基因RNA干扰（RNA interference，RNAi）慢病毒载体，并检测其对人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因表达的干扰效率。 研究指出，成功构建ALR基因RNAi慢病毒载体，该载体能有效干扰人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因的表达。 针对ALR基因RNAi的有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切线性化的GV118慢病毒载体连接产生LV-ALR-shRNA重组慢病毒载体，经转化感受态细胞后筛选出阳性克隆，并进行测序鉴定。用293T细胞包装产生慢病毒，逐孔稀释法测定病毒滴度。再将包装浓缩后的慢病毒转染人肝癌细胞株HepG2和QGY，应用Real-timePCR和Westernblot方法检测HepG2和QGY细胞中ALR基因mRNA和蛋白的表达情况。 酶切鉴定证实成功构建了针对人ALR基因的RNAi慢病毒载体，包装并浓缩慢病毒，病毒滴度为8E+8TU/ml。将病毒感染人肝癌细胞株HepG2和QGY后，2种细胞的干扰组ALR的mRNA表达水平较阴性对照组及空白对照组均明显下降（HepG2细胞，P干扰组vs.阴性病毒对照组=0.004，P干扰组vs.空白对照组=0.001；QGY细胞，P干扰组vs.阴性病毒对照组=0.005，P干扰组vs.空白对照组=0.001），同样，干扰组ALR在蛋白水平的表达也明显减降低。 （实习编辑：庄智伟）